Dalam biologi molekuler, pilihan buffer dan persiapan yang baik untuk langkah-langkah isolasi DNA yang berbeda dapat menjadi perbedaan antara beralih ke ekspresi protein atau membuka kit persiapan-maxi lain untuk memulai dari awal. Terlepas dari pentingnya mereka, resep buffer sering hanya itu – resep ditulis tanpa penjelasan atau alasan untuk komponen yang berbeda. Salah satu buffer tersebut adalah buffer glukosa-tris-EDTA atau GTE.
$config[code] not foundUntuk Apa GTE?
GTE digunakan untuk menghidupkan kembali pelet sel bakteri sebelum melisiskan (memecah) sel dan memanen DNA plasmid di dalamnya. Lisozim, yang melembutkan membran sel, sering ditambahkan bersama dengan buffer GTE. Mencapai penangguhan homogen seluruh sel selama langkah ini sehingga solusi lisis selanjutnya yang ditambahkan dapat mencapai semua sel adalah kunci untuk mendapatkan hasil DNA yang baik. GTE dirancang untuk melakukan ini sambil juga menyediakan lingkungan yang stabil untuk DNA.
Glukosa untuk Osmolaritas
50mM (milimolar) gula glukosa ditambahkan ke buffer GTE untuk mempertahankan osmolaritas di mana konsentrasi zat terlarut di luar sel dekat dengan yang ada di dalam sel. Ini mencegah lisis sel prematur, yang dapat menyebabkan hasil DNA yang lebih rendah karena agregasi dan degradasi. Komponen lain dari buffer juga berkontribusi terhadap osmolaritas larutan, tetapi glukosa, sebagai non-elektrolit, adalah pilihan yang baik karena tidak mengganggu sifat buffer larutan.
Tris untuk Stabilitas pH
Tris adalah nama pendek untuk tris (hidroksimetil) aminometana, yang merupakan buffer pH yang sangat umum. Dalam kasus buffer GTE, garam asam (Tris-HCl) ditambahkan ke buffer pada konsentrasi 25mM. Ini mempertahankan pH larutan pada mendekati 8.0 fisiologis, pH ideal untuk mencegah hidrolisis asam (degradasi) DNA plasmid dan reaksi samping yang tidak diinginkan dari komponen sel lainnya.
EDTA Mencegah Degradasi DNA
EDTA, atau asam ethylenediaminetetraacetic, menangkap atau "melelehkan" ion logam dari larutan, mencegah mereka dari berpartisipasi dalam reaksi samping yang tidak diinginkan. Dalam buffer GTE, EDTA ditambahkan pada 10mM. Tujuan utamanya adalah dalam buffer untuk mengumpulkan seng, magnesium, dan kalsium bebas, sehingga mencegah degradasi DNA oleh jalur tertentu yang membutuhkan logam tersebut.
Beberapa Tips Penting
Jaga agar buffer GTE Anda tetap dingin dan buatlah dalam jumlah kecil untuk mencegah pertumbuhan bakteri yang tidak diinginkan di dalamnya. Gula dan pH terkontrol membuat media pertumbuhan yang bagus. Selalu gunakan air murni. Air keran dapat memiliki ion logam berlebih dari pipa, yang dapat mengalahkan kemampuan EDTA untuk menangkap. Jika Anda mencurigai adanya gangguan RNA dalam sampel Anda, tambahkan RNase A pada 100 mikrogram per mililiter ke buffer GTE Anda untuk menghilangkan masalah.
